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蛋白质含量测定方法

来源:本站  类别:技术文章  更新时间:2013-09-16 11:18:02  阅读
 

蛋白质含量测定方法一般来说,有以下五种:凯氏定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)、紫外吸收法和考马斯亮蓝法(Bradford法)。

五种蛋白质含量测定方法的比较

方法

灵敏度

时间

原理

干扰物质

说明

凯氏定氮法

(Kjedahl法)

灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为 ±2%

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用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长

双缩脲法(Biuret法)

灵敏度低

1~20mg

中速

20~30分钟

多肽键+碱性Cu2®紫色络合物

硫酸铵;

Tris缓冲液;

某些氨基酸

用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似

紫外吸收法

较为灵敏

50~100mg

快速

5~10分钟

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收

各种嘌吟和嘧啶;

各种核苷酸

用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正

Folin-酚试剂法(Lowry法)

灵敏度高

5mg

慢速

40~60

分钟

双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原

硫酸铵;

Tris缓冲液;

甘氨酸;

各种硫醇

耗费时间长;操作要严格计时;

颜色深浅随不同蛋白质变化

考马斯亮蓝法(Bradford法)

灵敏度最高

1~5mg

快速

5~15分钟

考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm

强碱性缓冲液;

TritonX-100;

SDS

最好的方法;

干扰物质少;

颜色稳定;

颜色深浅随不同蛋白质变化

      从以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特点和优势,如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来,最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法)效率最高,无论是测定时间,灵敏度还是受干扰程度,都是比较占优势的。

    下面,我们来重点介绍一下其中一种蛋白质含量测定方法--凯氏定氮法。

凯氏定氮法(Kjedahl法)

首先将浓硫酸倒入样品中,边倒边摇晃,以使浓硫酸与样品充分接触,然后加热试剂。如果你需要加快实验进度,可以加入CuSO4作催化剂,这样,实验的反应时间就会大大缩短。CH2COOH和H2SO4反应生成氨气,然后氨气又与H2SO4发生作用,固定了氮元素。这时我们得到了(NH4)2SO4的溶液,然后我们可以用NaOH去跟硫酸铵反应,通过计算NaOH的使用量,就可以计算出氮的含量。下面是整个定氮法中发生的化学反应。

    CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3    (1)

    2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4                       (2)

    (NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3        (3)

       当我们得到氮的含量以后,我们就可以通过一定的计算,最终算出蛋白质的含量。

       凯氏定氮法常用于有机化合物中的氮含量的测定,是蛋白质含量测定的经典方法,虽然在测试过程中,试剂用量很大,但是,不可否认,它所适用的样品范围之广,测试结果之精确,都是公认的。

       现在,随着科技的发展,我们已经研究出带消化炉的凯氏定氮仪,它把定氮过程中的前两步骤通过仪器完成,方便了整个过程的实施。凯氏定氮仪能够自动的对样品进行消化,然后蒸馏,智能化完成,节省了时间和精力,提高了工作效率。这种蛋白质含量测定方法具有有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。浙江托普仪器有限公司提供这种产品,24小时服务热线:0571-87515059

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