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高温快速消化与国标消化的凯氏定氮法测定蛋白质含量的比较研究

来源:本站  类别:技术文章  更新时间:2014-01-23 11:34:35  阅读
1  方法
1.1  实验分组
分为2 组:对照组和实验组。两组在测定样本蛋白质含量的过程中,采用不同的消化方法,之后的蒸馏、滴定、计算方法,则完全相同。推荐使用仪器:蛋白质测定仪半自动定氮仪
1.1.1  对照组:操作严格按照国标规定〔1〕进行。其采用的消化方法为小火碳化消化法:取样品稀释液110 mL 与消化剂及硫酸一起加入定氮瓶内,于瓶口放一漏斗,将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上加热消化,消化过程要求小火(400 ℃) 碳化3 h 左右。
1.1.2  实验组:采用的消化方法是高温消化法:将样品稀释液110 mL 与消化剂一起加入定氮瓶内保持1 000 ℃的高温持续加热,其过程要求保持定氮瓶内液体沸腾,但所产生的蛋白质气泡不溢出瓶口,同时产生的蒸馏水气体在瓶壁遇冷回流,可以将瓶内壁上的蛋白质带回瓶底进行消化,整个消化过程大约1 h。
1.2  蛋白质含量检测
1.2.1  两组方法的稳定性、准确性比较: 分别对50 g/ L蛋白校准液(上海申索) 及15 份人血白蛋白样品(蛋白含量未知) 进行两种方法的蛋白质含量检测,前者重复15 次。
1.2.2  实验组蛋白回收率检测(见表1) :任取2 种含蛋白的样品A、B(蛋白含量未知) ,每种样品分别取3 份各916 mL ,加入50 g/ L 的蛋白标准液0μL 、100μL 、400μL 和分别对应400μL 、300μL 、0μL 的生理盐水,执行4 次重复试验,进行2 种方法的蛋白质含量检测。最后计算回收率。
1.3  统计学分析
数据以x ±SD 表示,两组间结果比较采用配对资料的t 检验及回归分析。
2  结果
2.1  两组方法的稳定性、准确性比较(见图1)对50 g/ L 蛋白校准液进行蛋白质含量检测结果,国标消化法为49.95 g/ L ±0.00 g/ L ,高温消化法为49.91 g/ L ±0.00 g/ L ,两种方法无显著差异( t= 1.1602 , P > 0.05) 。蛋白校准液氮含量检测结果:国标消化法为8.20 g/ L ±0.00 g/ L ,高温消化为8.21 g/ L ±0.00 g/ L , 2 种方法无显著差异( t = 1.000 , P > 0.05) 。对人血白蛋白样品进行蛋白质含量检测结果,国标消化法为97.61 g/ L ±0.57 g/ L ,高温消化法为97.65 g/ L ±0.55 g/ L ,两种方法无显著差异( t =0.5762 , P > 0.05) 。样品氮含量结果:国标消化法为15.6 g/ L ±0.01 g/ L ,高温消化为15.6 g/ L ±0.01g/ L ,两种方法无显著差异( t = 0.8069 , P > 0.05) 。
将两种方法对蛋白标液和样品检测结果进行回归分析(见图2) ,得出Y = 0.9987 X + 0.0797 , R2= 0.9999。
2.2  实验组蛋白回收率检测结果见表1。相对标准偏差分别为1.7 %、0.8 %、1.7 %和1.2 %,两种分别加入0μL 、100 μL 、400μL 、50 g/ L 的蛋白标准液的混合样品回收率分别为:98.0 %、97.5 %、98.0 %和98.5 %,平均为98.0 %。
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