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凯氏定氮法测定啤酒酵母碱溶性多糖中蛋白质的质量分数

来源:本站  类别:技术文章  更新时间:2014-01-09 10:56:38  阅读
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)属真菌,是单细胞微生物.啤酒酵母中含有25%~30%酵母多糖,主要是葡聚糖和甘露聚糖(MOS).其中,酵母葡聚糖主要由β-D-(1,3)糖苷键连接聚合而成,周期性的分支点主要是β-(1,6)糖苷键.酵母葡聚糖由于在人的消化器官中难以被消化,可以作为非卡路里食品添加剂,在冷冻甜点的生产中作为脂肪替代物;由于具有高持水能力,可用于香肠等肉制品中作为持水持油剂;也可作为膳食纤维来发挥作用.酵母葡聚糖作为一种功能因子,还具有独特生物活性.啤酒酵母碱溶性葡聚糖具有抗肿瘤、抗辐射损伤、抗炎、降低血脂等功能,可作为免疫调节剂,是一种良好的生物反应调节剂.葡聚糖的分离方法是引起葡聚糖分子量变化的主要因素,在分离过程中将酵母葡聚糖进行磷酸化修饰,可以有效降低葡聚糖的分支度使它具有很强的免疫调节活性.另外,葡聚糖是低热量食品,不易消化,因而可以减少血糖质量分数,预防糖尿病.在对啤酒酵母碱溶性多糖进行分离纯化研究时发现,其粗多糖和纯化后的单一级份多糖中都含有一定量的蛋白质.本文采用半微量凯氏定氮法,通过对其碱溶性多糖中蛋白质质量分数进行测定,以进一步了解啤酒酵母碱溶性多糖的功能、药用价值和作用机理,并为充分开发和利用这一真菌资源提供理论依据.
1 实验材料和仪器
1.1 材料
啤酒酵母用去离子水煮提3 次,每次1 h,3 500 r·min- 1,离心15 min,收集残渣,80℃烘干,干燥后保存备用。
1.2 实验仪器
凯氏定氮快速自动蒸馏器;多功能快速消化器;恒温定时控制仪;消化管架;250 mL直消化管;微量酸式滴定管;电子天平;电热恒温鼓风干燥箱;752 型紫外可见分光光度计。
2 实验方法
2.1 粗多糖的提取,分级与纯化
精密称取啤酒酵母粉末40.000g,加入1.0 mol/L 200 mLNaOH 溶液中,60℃水浴煮提3 次,每次1 h.合并滤液,减压浓缩至 50 mL,室温下用体积分数0.5 mol/L 盐酸溶液调溶液的pH 值为中性,4 000 r·min- 1 离心10 min,上清液加3 倍体积95%乙醇醇析过夜,4 000 r·min- 1 再离心10 min,然后用无水乙醇洗涤沉淀2 次,乙醚脱水, 常规干燥即得碱溶性啤酒酵母粗多糖AS.,将ASP 反复冻融后,分别以体积分数为30%,50%,70%的乙醇进行分级,相应得到3 个级份,其中以50%,70%乙醇分级所得沉淀为主要级份,进一步纯化。经Sevag 法脱蛋白、Sepharose CL-6B 凝胶过滤,得ASP2和ASP3.紫外分光光度计在波长280 nm 处分别检测ASP,ASP2和ASP3 是否有光吸收。
2.2 凯氏定氮法测定多糖中蛋白质质量分数
2.2.1 样品预处理 将待测样品ASP,ASP2和ASP3 粉末置于称量瓶中,在105℃烘箱中烘干6 h ,用坩埚钳取出放入干燥器内,降至室温后称质量,重复此操作,直至2 次称质量的质量数值不变,表明非游离水已被去除,样品质量已达恒质量,可用作消化.
2.2.2 消化 准确称取烘干至恒质量的多糖样品300 mg,放入250 mL 直消化管底部,加浓硫酸5 mL,加入混合催化剂(m (K2SO4)∶m (CuSO4)= 5∶1)800 mg,消化管置于多功能快速消化器中进行消化,直至消化液完全透明,呈现淡绿色为止.同时以0.1 mL 蒸馏水做空白对照实验.消化完毕,冷却至室温,消化液转入50 mL 容量瓶,以蒸馏水洗涤烧瓶2~3 次,并入容量瓶中,定容到刻度,备用.
2.2.3 蒸馏 精确吸取消化液5 mL 于消化管中,插接盛有样品的消化管;再取5 mL 质量分数为2%硼酸和1~2 滴混合指示剂于锥形瓶中;放置锥形瓶,使凯氏定氮快速自动蒸馏器装置的防回收滴管置于硼酸液面以下.然后加入质量分数为40 %NaOH 溶液过量,至烧瓶内液体变为深蓝色;按下蒸馏开关,通气后关闭排废液阀;加热蒸馏至氨全部蒸出.
2.2.4 滴定 将馏出液用0. 010 13 mol/L 盐酸标准溶液滴定至淡绿色变为粉红色即为终点,记录盐酸溶液体积的消耗量,平行做4 次,取平均值;同时做一空白对照.
2.2.5 蛋白质质量分数计算方法 计算公式为
蛋白质(%)=
式中: c 为盐酸溶液的体积分数,mol/L;V1 为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积,mL;V2 为滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液的体积,mL;F 为蛋白质系数,6.25;MN 为氮的摩尔质量,14.01 g/mol;m 为称量样品的质量,g;10 为样品的稀释倍数。
3 结果与分析
研究中,按2.1 的方法,ASP 经反复冻融、乙醇分级后,取其中以50%,70%乙醇分级所得沉淀为主要级份,进一步纯化,得ASP2 和ASP3.紫外分光光度计在490,280 nm 检测ASP,ASP2,ASP3 均有吸收峰,且在280 nm 处有紫外吸收峰,表明三者均含有蛋白质,见图1~图3.按2.2,凯氏定氮法结果见表1.经计算,分别得出ASP 中蛋白质质量分数是15.41%,ASP2 中蛋白质质量分数是3.17%,ASP3 中蛋白质质量分数是2.89%(见表1).
4 讨论
ASP2和ASP3 是由ASP 分级后纯化而得,在纯化中进行反复脱蛋白,仍检测到ASP2和ASP3 中蛋白质存在;经苯酚-硫酸法测定ASP2和ASP3的糖分布,发现ASP2和ASP3中所含蛋白质的分布与糖分布相同,表明ASP2和ASP3 中的蛋白质为结合蛋白质.啤酒酵母具有食用价值,其蛋白食品含有人体必需的8 种氨基酸,已接近理想蛋白质的水平.尤其是谷类食物中缺乏的赖氨酸含量丰富,可以改善人类的营养均衡.作为营养型食品, 测定其蛋白质的质量分数, 是食品分析的主要内容之一, 也是蛋白质结构分析的基础.本文采用的凯氏定氮法属于半微量定量测定蛋白质质量分数的方法, 符合食品中蛋白质质量分数测定的国家标准.目前,凯氏定氮法仍被广泛采用,是测定生物样品中蛋白质质量分数的经典方法.有关啤酒酵母碱溶性多糖中蛋白质的氨基酸组成及结构分析有待于进一步研究.
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